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实验猴生物学特性数据测定技术规程(讨论稿-3)(3)



2008-12-19 17:09:10.0 来源:E平台实验动物资源课题组 阅读次数:3796

6.2生理数据
      生理数据共包括8组数据。是实验动物生物学特性描述的主要数据群,也是实际中经常需要参考和使用的背景数据。本技术规程仅对其中涉及实验猴生理数据的“必需数据”的测定技术进行描述。
 
6.2.1样品采集
 
6.2.1.1血液
①采血前一般要求禁食12h。
②核对动物的性别、年龄等基本信息。(注:应先测量体重、体长等信息后再行血液采集操作)
③抓取固定 
见6.1.1.3 ②
④采血 
见6.1.1.3 ③④
⑤尽量避免血液与空气接触,并尽快检测,以保证血液pH测定数据的准确。
⑥用注射器采血时,应在采血后将针头取下,在将血液沿容器壁缓慢注入容器内。切勿用力过猛造成溶血。
⑦至少在采血后4小时测完全部数据。
 
6.2.1.2精液
①    采用电刺激法采集精液。用电流等物理方法刺激雄性动物的阴茎或其他性敏感区,使雄性动物被刺激发情,直至射精,用采精瓶采集射出的精液。
②    收集到的精液放入37℃水浴孵育30-45min后分离液化部分,测量液化体积,凝块体积。
①    精子计数及活力:取10μl精液加入37℃预热的双蒸水990μl(1:100),混匀后精子计数。取10μl精液加入90μl 37℃预热的TALP-Hepes(TH)培养液,混匀取20μl放到预先温热(37℃)硅化载玻片上,用20x20mm于倒置显微镜下观察精子存活百分率和活动度。
 
6.2.1.3阴道液
①在雌猴第一次月经,将无菌棉签蘸少量生理盐水润湿,轻轻插入雌猴阴道内0.5cm,轻轻旋转一下取出。
②把带有阴道内含物的棉签在载玻片上均匀转动作成涂片。
③然后将涂片在空气中自然干燥 。 
④用碱性美蓝溶液染色5min,用蒸馏水冲洗剩余的美蓝溶液,注意:应从涂片边缘慢慢冲洗,切勿把细胞冲掉(碱性美蓝溶液的配制:取美蓝0.3g,溶于95%乙醇30ml中,再加蒸馏水100ml及10%氢氧化钠水溶液0.1ml)。
⑤空气中自然干燥。
 
6.2.2分析仪器性能检查
      无论使用半自动还是全自动血液分析仪,进行测定前按照仪器使用规程进行自检,仪器各项指标正常后方可进行测定。而且,质控标准品数值在正常范围内,测定的数值才能有效。
 
6.2.3血液生理指标(必需数据)测定
       实验猴血液生理指标包括19项,其中红血球数、平均红细胞体积、血红蛋白、白细胞计数、嗜中性白细胞、嗜酸性白细胞、嗜碱性白细胞、淋巴细胞、单核细胞为必需数据。其他指标为丰富性数据。下面以使用全自动血液分析仪为例,描述必需数据的测定技术。
以使用日本光电MEK-7222K全自动血液分析仪为例,描述必需数据的测定技术。
6.2.3.1接通电源
6.2.3.2打开总开关
6.2.3.3打开启动开关,开机后,机器会自动清洗5min。
6.2.3.4进入待机画面,点击触摸屏“命令”,选择动物类别:大鼠、小鼠或其它;点击触摸屏“样品编号”,输入第一个样品的编号。
6.2.3.5机器默认的是末梢血,即:取血20μl,入稀释杯中稀释,小鼠等小体型动物多采用此法;如需检测静脉血,即:取全血,无须稀释,大体型动物可采用此法,机器需切换成静脉血模式。
6.2.3.6准备稀释液。
6.2.3.7取血20μl,接入稀释杯,尽快混匀。
6.2.3.8进样,注意:应保证样品完全吸入。
6.2.3.9每测一个样本约需时间1min。
6.2.3.10点击触摸屏“输出”,可每检测一个样本,传输一次数据;也可批量6.2.3.11传输:菜单?数据?输出
6.2.3.12每测10个样本,机器进入自动清洗状态。
6.2.3.13亮度调节钮,可调节显示屏亮度。
6.2.3.14若仪器出现报警,可进行手工清洗。
6.2.3.15橙色键为热启动键,可从任意画面返回待机界面。
6.2.3.16检测完毕,进行数据统计
6.2.3.17示例如下:
编号
WBC
RBC
HGB
HCT
MCV
MCH
MCHC
单位
*10^9/L
*10^12/L
g/L
%
fL
pg
g/L
数量
46
46
46
46
46
46
46
均值
6.31
6.60
130.43
42.55
64.56
19.86
307.65
标准差
1.474
.631
9.055
3.789
2.193
1.514
22.773
1
9.2
6.89
144
44.4
64.4
20.9
324
2
5.5
6.2
131
40.2
64.8
21.1
326
3
9.2
6.72
136
42.5
63.2
20.2
320
具体测定方法根据生理指标测定仪器和所用的试剂有所不同,各实验室应采用标准测定方法,制定详细的操作规程。
 
 
6.2.4生殖生理参数测定
 
6.2.4.1精液
精子计数
取重碳酸钠稀释液将精液作3倍稀释,破坏其粘稠性并用甲醛固定精子,混匀后滴入计数池,显微镜下计数。
精子活力
见6.2.1.2 ③。注意未成熟的和异常的精子,以及精子运动的情况。精子存活率≥80%才能授孕。
 
6.2.4.2阴道液
在显微镜下观察阴道涂片的组织学变化,确定月经周期的不同阶段。月经前期  涂片中细胞成堆,边缘折卷胞质皱折,细胞边界不清。粘液与中性粒细胞增远销,见裸核、细胞坏死碎屑及阴道杆菌崩解碎屑。月经期  涂片内见大量红细胞、粘液和中性粒细胞。行经第二天可见成群子宫内膜细胞。月经后期涂片中以角化前细胞为主,角化细胞开始逐渐增多。
 
6.2.4.3性成熟
实验猴第一次月经,即为性成熟。
 
6.2.4.4 性周期
从雌猴开始第一次月经的第一天算起到下一个周期出血所经过的时间为性周期,以天计算,描述为 ±S。
 
6.2.4.5妊娠期
①首先观察和记录雌猴的月经,在月经开始后的第10~11天,将雌猴放进雄猴笼内,让其同笼交配,此时计为妊娠期第一天。
③观察至仔猴出生日,即为妊娠期最后一天,计算总天数,即为整个妊娠期。妊娠期以天计算,描述为 ±S。
 
6.2.4.6哺乳期
①将猴出生日计为哺乳期第一天。
②第4~5月,离乳,此天记为哺乳期最后一天,哺乳期以天计算,描述为 ±S。
 
6.2.5免疫生理参数测定(IgG和IgM)
 
6.2.5.1琼脂板扩散法
免疫球蛋白标准曲线制备
①将冻干的标准参考血清用0.5ml蒸馏水溶解,再按说明书的要求用生理盐水将血清稀释成不同浓度,分别滴入相应的抗体琼脂板孔内,每孔10?L。
② 置湿盒内,经37℃扩散48h后,测定沉淀直径。
③以不同稀释度标准含量为纵坐标,沉淀环直径为横坐标,在半对数坐标纸上绘制标准曲线。
待检血清浓度测定
①单价免疫球蛋白抗血清琼脂板制备:将8g/L琼脂糖凝胶水浴加热溶化,待琼脂凉到56℃左右时,加入适量抗血清(按说明书所标明的稀释度比例加入),轻轻摇匀,立即倒在洁净的玻璃板上,每平方厘米玻璃板加琼脂约0.15~0.2ml,凝固后打孔,孔径3mm,孔距1.2cm。
②标本稀释待检血清按所测免疫球蛋白的种类不同,稀释倍数不同。测IgG按1:50稀释,测IgM按1:4稀释。稀释待检血清常用生理盐水。
③加样:将稀释的待检血清用微量加样器准确吸入10?l,加入相应的琼脂板小孔内。
④温育 将已经加样的琼脂板放在湿盒内,置37℃温箱孵育48h。
⑤测量各种免疫球蛋白沉淀环直径(如果条件允许,可在暗室内将照相纸放在琼脂板下,曝光后印成照片,然后测量沉淀环直径)。根据抗原抗体比例适当时出现沉淀环最清晰明显的原则,选择最适的沉淀环。
结果判定
根据标本沉淀环直径大小,在相应的标准曲线上查出免疫球蛋白含量,乘以血清稀释倍数即为标准血清 Ig浓度。
 
6.2.5.2免疫生理参数测定(IgG和IgM)酶联免疫吸附法
①标准曲线制作 
配制标准猴 IgG浓度为0 ~5. 6μg/L ,测定波长为490 nm。以浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线。
②包被抗原(人抗猴IgG)
根据滴定的最适工作浓度,将抗原用包被液稀释。每孔100μl,置37℃1 h后再4℃过夜。用洗涤液洗5次,每次3min,叩干。
③加样
待检血清和标准血清分别用稀释液做1∶40稀释,每孔100μl,37℃1 h,洗涤同上。
④加酶结合物
 用稀释液将酶结合物稀释至适当浓度,每孔加入100μl,37℃1 h,洗涤同上。
⑤加底物溶液
 每孔加入新配制的底物溶液100μl,置37℃,避光显色10~15 min。
⑥终止反应
每孔加入终止液50μl。
⑦测A
在酶标仪上,于490nm处读出各孔A值。
⑧根据标准曲线确定IgG和IgM浓度
 
6.2.6 生长发育生理参数
 
6.2.6.1出生体重的测定
①测定雌性动物所产的全部仔数,至少测60只。
②选择适宜称量范围的天平称重。
③动物出生2天内进行测定。
④统计平均体重。出生体重以Kg计算,描述为 ±S。
 
6.2.6.2离乳体重的测定
①选取测定出生体重的猴进行离乳体重的测定。
②称量4~5月时猴的体重。
③统计平均体重。离乳体重以Kg计算,描述为 ±S。
 
6.2.6.3成年体重
①选取测定离乳体重的猴进行成年体重的测定。
②称量3岁龄猴体重。
③统计平均体重。成年体重以Kg计算,描述为 ±S。
 
6.2.6.3生长曲线
①对测定出生体重时所选择的动物种群绘制生长曲线。
②动物出生后离乳前每月测定一次体重,至1岁,以后每年测一次至动物5岁。
④以时间(月)为横坐标,体重(Kg)为纵坐标绘制生长曲线。
 

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